ATCC細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)*手冊(cè)
　　細(xì)胞是我們很多基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)，那么細(xì)胞能否被成功復(fù)蘇就尤為重要了。
　　美國(guó)菌種保藏中心， 又稱美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)，是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營(yíng)的，非贏利性組織。目前它可以提供各種動(dòng)植物細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品、菌株達(dá)兩萬(wàn)多種。以下是來(lái)自ATCC的*說(shuō)明，小凳子搬起來(lái)。
　　01　　收到細(xì)胞的注意事項(xiàng)
　　凍存的ATCC細(xì)胞株和雜交瘤細(xì)胞株在運(yùn)送過(guò)程中使用干冰保持低溫。收到凍存細(xì)胞后，可以立即解凍復(fù)蘇，去除二甲基亞砜（DMSO）后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。如果不立即復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，必須將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐存儲(chǔ)。請(qǐng)不要將細(xì)胞存儲(chǔ)在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低，達(dá)不到-130℃，細(xì)胞活力會(huì)迅速下降。
　　對(duì)于浸沒(méi)在液氮中細(xì)胞，在復(fù)蘇時(shí)需要特別留意，如果在存儲(chǔ)過(guò)程中凍存管出現(xiàn)泄露，液氮會(huì)緩慢的進(jìn)入其中；這樣在解凍的過(guò)程中，液氮的揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致凍存管爆炸或?qū)龃婀苌w掀起，引起碎片飛濺非常危險(xiǎn)。
　　安全防護(hù)：在從液氮中取凍存管以及解凍的過(guò)程中，要始終穿戴防護(hù)服、手套以及面罩。
　　2　　產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和質(zhì)檢報(bào)告（COA）
　　ATCC每個(gè)細(xì)胞株都有一份產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（product sheet），其中包含細(xì)胞株的信息和詳細(xì)的操作指南。細(xì)胞株的所有詳細(xì)介紹可以在 ATCC 網(wǎng)站找到，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)和COA也可以從ATCC網(wǎng)站下載。
　　3　　凍存細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)
　　1. 準(zhǔn)備工作
　　先準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶，及產(chǎn)品說(shuō)明推薦的相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基。并在37℃水浴中預(yù)先溫?zé)峒?xì)胞培養(yǎng)基。
　　2. 37℃水浴
　　小心取出裝有細(xì)胞的凍存管，保持管蓋擰緊，將凍存管蓋以下的部分置于37℃水浴中并輕微的攪拌以幫助解凍。解凍過(guò)程應(yīng)該盡快，大約短于2分鐘或待后一塊小冰晶體剛?cè)诨蛻?yīng)將細(xì)胞凍存管取出水浴。
　　（注意：一定要快速融化冰晶，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。所以，要避免水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致溫度不夠）
　　3. 消毒和無(wú)菌
　　在從水浴中取出的細(xì)胞凍存管表面噴灑70%乙醇配制的消毒劑，用無(wú)菌紙巾或紗布試干。之后的操作步驟都應(yīng)該遵循在無(wú)菌條件下生物安全柜中嚴(yán)格操作。
　　注意：隨時(shí)更換吸頭和吸管，避免交叉污染。
　　4. 離心
　　小心擰開(kāi)凍存管的頂部，將管內(nèi)容物用1ml移液槍轉(zhuǎn)移到含9毫升培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中。離心5到7分鐘(125×g),小心吸去上清液以去除抗凍劑(二甲基亞砜)，避免丟失細(xì)胞沉淀。
　　注意：對(duì)于多數(shù)細(xì)胞系而言，不需要立即去除凍存液，通常可在復(fù)蘇后8-24小時(shí)換液進(jìn)行去除（但對(duì)于一些對(duì)凍存液敏感的細(xì)胞，我們就需要先進(jìn)行細(xì)胞離心以除去凍存液）。
　　5. 重懸
　　將細(xì)胞沉淀重懸于配好的*培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻的分布。
　　生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞株可重懸于5-8ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶。生長(zhǎng)較快的細(xì)胞株可重懸于12-20ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T75培養(yǎng)瓶。ATCC網(wǎng)站有各個(gè)細(xì)胞株的具體生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)方法記載。
　　A. 復(fù)蘇過(guò)程中應(yīng)避免使用過(guò)度堿性的培養(yǎng)液（通常我們的培養(yǎng)液中都含有酚紅作為pH指示劑，因此這里既盡量不要使用因偏堿而變紫的培養(yǎng)液）。建議事先將培養(yǎng)容器中加入培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中孵育不少于15min，以使培養(yǎng)液達(dá)到其正常的pH值，然后再加入凍存的細(xì)胞。
　　B.某些細(xì)胞系在解凍后，當(dāng)過(guò)于快速的加入大量新鮮培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)滲透壓休克。此時(shí)應(yīng)使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加（每次1-2ml）新鮮培養(yǎng)液的方法，每隔10-20min添加一次新鮮培養(yǎng)液。
　　6. 培養(yǎng)
　　將細(xì)胞培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，在溫度37℃, 二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。
　　為了確保細(xì)胞活力、遺傳基因型穩(wěn)定和表型的穩(wěn)定，細(xì)胞株的培養(yǎng)需要保持在對(duì)數(shù)期。這意味著需要定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。并且注意在細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期之前，即單層細(xì)胞100%匯合長(zhǎng)滿前或懸浮細(xì)胞達(dá)到其推薦的大細(xì)胞密度之前，要進(jìn)行細(xì)胞傳代。監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和繪制每個(gè)細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線都有助于確定細(xì)胞株的生長(zhǎng)特性。